바이오인

핵심내용

살아있는 세포로 심혈관질환 알아낸다
 - 심혈관질환 마커 정밀검출을 위한 세포 센서 개발 성공 -

□ 심혈관 질환을 진단할 수 있는 중요한 바이오마커를 살아 있는 세포를 이용하여 측정할 수 있는 기술이 처음으로 개발되었다.

□ 한국연구재단(이사장 조무제)은 최종훈 교수(중앙대) 연구팀이 염증 및 심혈관 마커인 CRP*를 살아있는 면역세포를 이용하여 실시간으로 검출할 수 있는 기술을 최초로 개발하였다고 밝혔다.
     *CRP(C-reactive protein) : 심혈관 질환의 경우 혈액 내에 증가하는 단백질

□ 연구팀은 압타머(Aptamer)*를 인간 면역세포에 공학적 설계, 기술로 결합시켜 면역세포의 기능을 수행하는 동시에 목적 단백질을 검출하게 하였다. CRP의 검출은 임상에서 효소면역측정 방법* 등으로 활용 되고 있으나, 살아있는 인간 세포를 매개로 직접 CRP를 감지하는 기술은 이번이 처음이다. 
     *Aptamer: 단일가닥DNA 혹은 RNA로 대상이 되는 단백질 등에 특이적으로 결합하는 특징을 가짐
     ＊효소면역측정 방법(ELISA, Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) : 항원을 정량적으로 검출하기 위하여 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 쌍을 활용하여, 항원을 고정화 한 뒤 효소반응 등을 통해 항원의 양을 측정하는 기술

□ 지금까지의 목적 단백질의 검출기술은 검출 표지자를 기본으로 하는 체외 분석이 대부분이었다 이 연구는 세포 자체가 하나 하나의 센서가 되고 또한 그 본연의 기능을 가지고 있는 살아있는 세포 이므로 생체 내에서 목적 단백질을 검출할 수 있는 플랫폼을 확립하게 되었다. 특히 백혈구는 염증 부위로 이동하여 면역반응을 일으키거나 치유 등에 관여한다. 이러한 백혈구에 염증 특이 마커인 CRP를 검출할 수 있는 압타머를 부착함으로써 염증부위로 이동하는 백혈구를 직접적으로 확인할 수 있고 세포와 주위 분자 간의 상호관계를 파악할 수 있는 기틀을 마련한 것이 주목할 점이다.

□ 또한 이 연구에서는 면역세포 자체를 센서로 사용함으로써 목적단백질의 검출은 물론 세포주위 환경과 세포자체의 안정성에 영향을 미치는 인자 등을 확인하였고, 목적 타깃 물질이 다수 존재하는 영역에 면역세포들이 도달함으로 면역기능의 활성 및 면역 치료에효과를 나타내는지에 대한 기초적 접근법을 마련하였다.

□ 최종훈 교수는“이 연구성과는 살아있는 인간 면역세포를 공학적으로 설계하여 특정 질환마커를 선택적으로 검출할 수 있게 한 혁신적인 연구이다. 심혈관 질환 진단 및 치료에 적용될 것으로 기대된다.”라고 연구의 의의를 설명했다.

□ 이 연구성과는 미래창조과학부(한국연구재단) 기초연구사업(개인연구) 지원 등으로 수행되었으며, 국제 학술지 사이언티픽 리포츠(Scientific reports) 10월 6일자에 게재되었다.

논문의 주요 내용

□ 논문명, 저자정보

   - 논문명 : Scientific Reports (http://www.nature.com/articles/srep34778)
   - 저자 정보 : 최종훈 (교신저자), 황장선 (제1저자), 서영민, 조연호, 손재우

□ 논문의 주요 내용

 1. 연구의 필요성
   ○ 심혈관 질환 발병의 초기에 혈액 내에서 증가하는 C-reactive Protein (CRP) 의 양을 혈관 내에서 존재하고 살아있는 인간 면역세포를 통해 검출하여 실시간 질환 양상을 리포트 하기 위함.
   ○ 심혈관 질환이 발생한 염증 부위에 집적될 CRP의 집합에 면역세포를 유도하여, 이들이 바이오센싱 뿐만 아니라, 염증 부위에서 적절한 면역 반응을 발생하여 치료과정에 이르게 하기 위함.

 2. 연구내용
   ○ CRP에 선택적으로 결합하는 압타머(aptamer)를 인간 면역세포의 표면에 부착시켜 이들이 CRP 농도에 따라 비례하게 면역세포를 통해 센싱할 수 있으며 그의 과정을 바이오컨쥬게이션*을 통해 개발하여 살아있는 상태로 면역세포가 세포센서 역할을 하게 개발함.
     ＊바이오컨쥬게이션 (bioconjugation): 두 생체물질을 결합하기 위하여 결합의 작용기들을 찾아 서로 연결 분자 (crosslinker)등을 통해 결합시키는 기술
   ○ CRP를 센싱하도록 공학적으로 설계되고 제작된 살아있는 인간면역세포는 면역세포로서의 역할, 즉 자극에 반응하여 사이토카인을 분비하는 기능에 있어서 항상성이 유지되도록 개발하였고, CRP의 높은 농도 부위로 면역세포들이 이동하게 유도할 수 있는 기술을 개발함.

3. 연구 성과
   ○ 개발된 Apt-PBMCs*를 통하여 타깃 물질을 정량적으로 검출할 수 있음을 확인하고 검출의 최저 한계 농도 또한 ELISA등의 기존 기술과 동등한 수준으로 개발하였음.
   ○ 개발된 Apt-PBMCs 구조체는 면역세포를 기반으로 하여 생산되었으며, 면역세포의 활성지표인 TNF-alpha의 분비량을 통해  Apt-PBMCs 구조체가 연속된 표면 기능화 이후에도 생존해 있으며 면역세포로서의 원래 기능을 유지 할 수 있음을 확인함. 또한 인공적으로 조성된 혈관모사칩에서의 평가 결과도 CRP농도에 따라 Apt-PBMCs 구조체의 이동 양상을 확인 할 수 있어 잠재적으로 Apt-PBMCs 구조체와 목적 단백질, 또는 목적 수용체들과의 결합메커니즘을 분석하는 유용한 툴로 사용 될 것으로 기대됨.
           *Apt-PBMCs 구조체 : 말초혈액 단핵구 (PBMCs)의 표면 단백질에 바이오틴, 스트렙타비딘, 바이오틴/압타를 순차적으로 결합시켜 인공 적으로 만든 압타머가 결합된 면역세포

상세내용

 
연 구 결 과  개 요

 1. 연구배경

 ○ 단가닥 DNA인 압타머 (aptamer)는 항체에 비하여 결합력은 비슷하거나 큰 반면에, 외부환경인 열, pH, 압력 등에 대해 항체에 비해 안정적이어 그에 대한 개발과 응용 연구가 활발히 이루어져 오고 있다. 단가닥  DNA 또는 RNA 압타머는 목적 단백질의 특이 도메인에 결합하며, 압타머에 형광인자를 생체물질 수식(bioconjugation)함으로 이에 기반한 목적 단백질의 바이오 센싱을 가능하게 하고, 이러한 기술을 바이오칩 또는 바이오어레이 상에서 구현이 가능하다. 그러나 체외에서 압타머를 프로브로 한 바이오 센싱 기술은 비약적으로 발전해 온 반면, 체내에서 세포센서로서의 응용은 세포독성등과 같은 기술적 문제점에 의해 제약이 있어왔다. 압타머가 부착된 세포, 특히 면역세포를 매개로하는 바이오센싱 기술 또한 세포자체의 안정성, 활성, 목적 단백질의 타겟팅 등 여러 가지 극복해야 할 기술적 제약이 따른다. 따라서 세포센서로서 그 기능을 수행하기 위해서는 압타머의 도입이후에도 세포가 사멸하지 않아야 하며, 세포 표면의 단백질 및 수용체가 손상되지 않아야 하며, 고감도로 목적 단백질을 검출 할 수 있어야 한다. 

 2. 연구내용

○ 이 연구에서는 가교결합 분자를 도입하여 세포와 바이오틴 (biotin)을 결합시키고 바이오틴-스트렙타비딘*(streptavidin) 상호간의 결합을 기본으로 하는 세포센서 중간체를 합성 하여 바이오틴이 결합된 압타머를 최종적으로 붙여 Apt-PBMCs의 구조를 확립하였다. 이렇게 결합된 Apt-PBMCs 구조체는 압타머의 특성에 따라 다양한 목적 단백질을 검출 할 수 있으며 본 연구에서는 CRP를 검출하는 면역세포센서를 개발하였다.
       *바이오틴-스트렙타비딘 : 비타민의 일종인 바이오틴은 세균유래 스트렙타비딘과 특이하게 결합하며 1개의 스트렙타비딘 분자에 4개의 바이오틴 분자가 결합하며, 바이오분야에서 다양하게 활용되고 있다.
○ 이 연구의 Apt-PBMCs 구조체의 형성은 단계별로 세포 표면에 부착되는 분자들을 형광염색하여 그 과정을 형광 이미징하여 부착의 성공 여부를 판별하였다. 
○ 연구팀이 개발한 Apt-PBMCs 구조체는 면역세포를 기반으로 하여 생산되었으며, 면역세포의 활성지표인 TNF-alpha*의 분비량을 통해  Apt-PBMCs 구조체가 연속된 표면 기능화 이후에도 생존해 있으며 면역세포로서의 원래 기능을 유지 할 수 있음을 확인 하였다. 또한 인공적으로 조성된 혈관모사칩 에서의 평가 결과도 CRP농도에 따라 Apt-PBMCs 구조체의 이동 양상을 확인 할 수 있어 잠재적으로  Apt-PBMCs 구조체와 목적 단백질, 또는 목적 수용체들과의 결합메커니즘을 분석하는 유용한 툴로 사용 될 것으로 기대 된다.
     *TNF-alpha : TNFα는 염증성 반응에 관여 하는 사이토카인 (cytokine)으로 마크로파지 (macrophage) 또는 T세포에 의해 분비 되어 IL-1 and IL-6 (인터루킨-1, 6)I등과 같은 다른 사이토카인의 분비를 조절 하거나 세포사멸 (Apoptosis) 등을 통하여 세포 매개 면역반응을 조절함.
 

3. 기대효과

○ 이 기술을 통해 살아있는 세포 자체가 바이오센서로 활용 될 수 있음을 증명하였고, 표면 기능화 이후에도 여전히 면역세포로써의 기능을 수행 할 수 있음을 증명하였다. 이는 세포 상호 간의 시그널링 또는 세포와 분사사이의 메커니즘 분석 등에 유용하게 쓰일 것으로 사료된다. 지금까지 체외 센싱이 대부분의 바이오 물질 검출을 위한 센서 개발의 주 목적이었지만, 이 연구를 통해 살아있는 인간면역세포를 활용하여 체내에서 목적 단백질의 검출 또한 가능하다는 것을 입증하였다. 향후 전 임상 실험을 통한 면역세포센서의 질환 부위로의 이동과 그를 통한 질환 마커의 검출, 그리고 더 나아가 질환 부위에 유도된 면역세포들을 통한 면역 치료 등의 기술에 다양하게 적용될 것으로 기대된다.

★ 연구 이야기 ★

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

Aptamer의 개발과 이를 활용한 타깃 마커의 바이오센싱은 활발히 연구가 진행되어 오고 있다. 또한 체외에서 특정 단백질의 검출 기술 또한 이미 상용화 되었거나 연구 개발이 한창 진행 되고 있다. 그러나 살아있는 세포를 이용하여 최종적으로 생체 내에서 목적 단백질을 검출 할 수 있는 기술은 아직 확립되지 않은 상태이고 이러한 가운데, 목적단백질을 실시간 또는 직접적으로 살아있는 면역세포를 활용하여 검출 할 수 있는 기술을 개발하고자 하였다.

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

본 연구팀은 혈관 내 염증 반응의 부위에서 특정한 마커들이 발현되어, 이를 인식하는 면역세포들이 그 위치에 모이고, 모여든 면역세포들이 프로그램된 면역반응을 시작하고, 염증 부위로 혈관벽을 통과하여 이동하면서, 치료의 과정이 발생함을 주목하였다. 이 과정을 통해 면역세포 표면에 염증 마커를 선택적으로 감도 높게 결합하는 aptamer들을 공학적으로 설계하여 기능화 한다면 검출하고자 하는 염증 마커를 세포를 통해 특이적으로 타깃팅 하고 결과적으로 바이오센서로서 세포를 사용할 수 있을 것이라 기대하여 연구를 시작하였다.

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

인간면역세포가 실험 초기부터 끝까지 살아있어야 하고 반응시킨 시약 등에 의해 영향을 받지 않아야하므로 이런 일련의 과정을 완성하는 것이 실험자로서 가장 도전이 되는 부분이었다. 이 문제점은 칼슘 이온 등에 의한 세포막의 손상에 의해 발생 가능한 문제들로, 완충용액의 조성을 변화시키면서 세포센서로서의 최적 조건을 찾아내었다. 또한 바이오틴, 스트렙타비딘, 압타머 등의 도입시 각각의 결합 결과를 손쉽게 확인하기가 도전적이어, 각각의 과정에 참여하는 분자들을 직접적으로 형광 염색하여, 결합 과정에 따른 세포 표면위 형광 발광을 확인하여, 결합이 성공적임을 확인하였다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

바이오틴/스트렙타비딘 결합과 같은 선택적인 분자 결합력을 활용한 바이오센싱 기술은 쉽게 접할 수 있고, 많은 연구가 진행 되어온 압타머의 활용 또한 그 연구 내용들을 쉽게 접할 수 있다. 그러나 살아있는 면역세포에 이들을 직접 적용하여 타깃 질환인자를 살아있는 면역세포가 바이오센싱을 하는 연구의 목표와 내용은 혁신적이고 창의적이다.
압타머를 이용하여 본 연구에서는 심혈관질환 마커로 잘 알려진 CRP를 탐지하였지만, 타깃 물질에 따라 압타머만 바꾸어 준다면 세포 수용체, 사이토카인, 펩타이드 등과 같은 여러 가지 관심 바이오마커를 탐지 할 수 있어 인위적으로 조성된 마이크로환경에서 세포와 표적 분자간의 상호활동을 이미징화 할 수 있을 것으로 기대된다.

□ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은?

Apt-PBMC가 면역세포이니 만큼 이 구조체가 암 등의 특정부위에 직접적으로 결합되어 면역 세포에의해 면역치료 반응 및 면역 활성 반응등을 유도하는 것이 추후 개발의 목표이다. 그리고 압타머 대신 면역세포를 활성화 시킬 수 있는 인자 등을 탑재하여, 면역세포들 서로간의 면역 활성화를 유도하는 연구 또한 진행 중이다.

□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?

이번 연구에 대해 학술발표 등의 기회를 통해 많은 관심을 받았으며, 또한 유용한 질문을 받았었다. 예를 들어 “흥미로운 연구이긴 하나 이것으로 무엇을 얻고자 하는가?” 등과 같은 개발 기술의 실제적인 상용화와 활용 분야에 대한 내용이 추후 연구 추진을 위해 도움이 되었다.

용 어 설 명

1. Apt-PBMCs 구조체 (압타머-면역세포 구조체)
   압타머를 바이오컨쥬게이션 기법으로 면역세포, 특히 T 또는 B cell 에 결합시킨 세포 구조체로서 면역세포의 기능뿐 아니라 탑재된 압타머에 의해 목적 단백질을 직접적으로 검출 할 수 있게 만든 세포센서

2. PBMCs (말초혈액 단핵구; Peripheral Blood Mononuclear Cells )
   혈액에 분포하는 면역세포의 집단으로 하나의 핵을 가지는 lymphocyte, monocyte등을 의미함.

3. Aptamer (압타머)
   단가닥의 DNA 또는 RNA로 3차원적 구조를 가지며 목적 단백질 또는 펩타이드 등의 특정 도메인에 선택적으로 결합함.

4. TNF-alpha
   TNF α는 염증성 반응에 관여 하는 사이토카인 (cytokine)으로 마크로파지 (macrophage) 또는 T 세포에 의해 분비 되어 IL-1 and IL-6 등과 같은 다른 사이토카인의 분비를 조절 하거나 Apoptosis등을 통하여 세포 매개 면역반응을 조절함.

그 림 설 명

(그림 1) CRP를 직접적으로 검출할수 있는 Apt-PBMC 모식도

면역세포 표면의 아민기에 바이오틴을 링커로 붙인 다음 스트렙타비딘을 연결시키고 이후 바이오틴이 결합되어 있는 압타머를 붙임으로써 Apt-PBMC 구조체를 완성하게 된다. 이 구조체는 압타머에 의해 실시간으로 CRP를 농도를 직접 검출 하게 되고 이때 넣어준 검출항체(reporter antibody)*에 의하여 형광을 발생하게 된다. 또한 Apt-PBMC는 살아있는 인간면역세포에 기반하기 때문에 CRP를 검출하는 동시에 면역세포로서의 원래 특성인 면역기능을 같이 수행하게 된다. 

* 검출항제 :  Apt-PBMCs 구조체와 CRP결합을 확인하기 위해 CRP에 특이적으로 반응하는 형광이 라벨링된 항체; 이미지와 CRP농도에 대한 형광의 세기증가로 CRP검출결과를 확인할 수 있게 한다.

세포 하나하나가 센서로서 작용하게 되며 CRP농도에 따라 형광(붉은색)이 진해지는 것을 확인 할 수 있다. (세포 핵의 염색을 위한 DAPI* 염색:청색과 형광이 라벨링된 검출항체를 통한 Apt-PBMC/CRP의 결합 확인:적색) 

*DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole): DNA에 결합하는 유기 화합물로 세포핵 염색에 주로 사용되며 자외선 조사 시 청색을 띈다.

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