바이오인

출처 : 국립보건원

유전자치료에 사용되는 세포주관리규칙

I. 서론

이 지침의 목적은 유전자치료에 관련되는 연구원들이 유전자치료에 사용되는 세포주를 실험 실에서 관리하는 데 필요한 정보 및 주의사항들을 제공하는 것이다. 이 지침에 따라 세포주 를 관리함으로서 세포주에서 균일한 최종산물이 만들어지고 외래물질로 인한 감염이 없을 것이다.

생명공학의 발전은 급속하게 진행되고 있다. 고유한 성상, 사용된 세포주와 생산과정에 따라 각각의 새로운 생산물은 달리 평가되어야 한다. 그러므로 새롭고 중요한 발견이 있을 때마 다 이 지침의 내용은 바뀌어져야 한다. 이 지침에서 세포주관리에 관한 모든 것을 모든 것 을 포함하지 않는다. 특수상황에서는 다르게 접근할 수 있고, 어떤 면은 모든 상황에 적합하 지 않을 수 있다. 게다가 여기서 고려되는 사항들이 적절한지 결정하는 과학적 기초는 빨리 발달되고 있기에 향후 좀 더 적절한 지침이 있어야 할 것이다.

이 규칙은 미국 보건성에서 발행된 Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals (1993)에 기초하여 만들어졌으며 아래와 같은 내용에 촛점을 맞추고 있다.

1. 세포의 생산, 확인, 성상화
2. 외래감염물질을 제거하거나 불활성화시키는 생산과정의 검증
3. 안전성을 보장하기 위한 최종 산물과 그 lot의 검사

이 지침에서 서술한 검사의 결과에 의하여 유전자치료제제를 생산하는 세포주가 적합하다는 것을 제시하므로 이러한 검사는 Good Laboratory Practice 요구조건에 따라 수행되어야 한 다. 검사항목의 선택은 세포주의 특성, 생산환경, 생산물 사용조건등과 같은 여러 변수에 따 라 달라질 수 있다. 초기임상실험에 필요한 검사는 생산물과 생산물의 사용에 따라 달라진 다. 여기에서는 검사선택에 관한 기준을 서술하지 않는다. 왜냐하면 이러한 결정을 내릴 때 각각의 생산자들이 고려해야 하는 사항들이 다양하기 때문이다.

유전자치료제제의 제조에 사용되는 세포주는 다음과 같은 면에서 유지·관리되어야 한다.

1. 세포주의 내력과 일반적인 성상
2. 세포은행체계
3. 생산세포와 생산물검사
4. 정도관리검사
5. virus 제거의 확인

II. 세포주의 내력과 일반적인 성상

A. 세포주의 내력

유전자치료제제의 생산에 사용된 세포주의 내력은 가능하다면 다음과 같은 내용을 포함해야 한다.

1. 공여자의 나이, 성별, 종
2. 인간세포주의 경우, 공여자의 병력과 가능하다면 외래감염인자를 검출하기 위해 공 여자에 수행된 검사결과
3. 세포주가 유래된 조직을 분리하는데 사용된 방법 등을 포함한 세포주의 배양내력, 계대배양 내력, 사용된 배지와 동물에서의 계대배양내력 등
4. 이전에 수행된 정체확인검사와 모든 외래감염물질 검사결과

B. 세포주의 일반적인 성상

세포주의 성장양상과 형태학적 모양이 결정되어야 하고, master cell bank로부터 최종생산 세포까지 일정하게 유지되어야 한다. 만약 세포주 성상화에 이용되는 특정표지가 (예를 들 어 염색체나 특정세포표면표지) 있다면, 이러한 표지의 안정성에 관해 서술되어야 한다. 만 약 세포의 평균수명이 알려지면, 세포숫자가 2배가 되는 2배가수준이 결정되어야 한다.

III. 세포은행체계

A. 세포은행설립

일단 세포주가 유전자치료제제의 공급원으로 선택되면, 세포은행체계가 만들어져 장기간 동 일한 세포가 적절하게 공급될 수 있게 하여야 한다. 세포은행체계의 잇점은 처음에 사용한 물질을 일정하게 공급한다는 것 뿐 아니라, 세포주의 자세한 성상화, 세포주사이의 오염과 외래감염인자에 의한 오염 모두의 검출을 증가시키고, 오염을 감소시킬 수 있는 가능성이다. 일반적으로 세포은행체계는 2가지로 구성되어 있다; master cell bank (MCB)와 manufacturer's working cell bank (MWCB).

MCB는 단일 세포나 조직으로부터 유래한 단일 구성의 세포조합이다. MCB는 분주되어 액 체질소에 냉동보관된다. 2배체세포주의 MCB는 낮은 2배가수준의 세포로부터 준비된다.

MWCB는 한개나 여러개 앰플의 MCB로부터 얻어진다. MCB 원래의 세포는 생산자에 의해 선택되고 원하는 계대배양수까지 몇번의 배양에 의해 증폭된다. 계대배양된 시점에, 세포들 은 하나로 모아져서 각개의 앰플로 나누어져 냉동보관되어 MWCB가 된다. MWCB의 한 개나 여러개의 앰플은 유전자치료제제를 생산하는 데 사용되어 진다. 만약 여러개 앰플의 세포가 사용되어지면, 녹일 때에 한군데로 모아야 한다. 이 때에 생산에 사용된 세포의 2배 가수준이 한계이하이어야 한다.

B. 세포은행의 저장

MCB와 MWCB는 액체질소에 저장되어야 한다. 세포의 각 앰플의 위치와 목록은 기록되어 야 한다. MCB와 MWCB는 세포주의 손실을 피하기 위해 따로 멀리 떨어질 뿐 아니라 생산 시설안에 분리된 지역에 각각 저장되어야 한다.

C. 세포은행의 평가

1. Mater Cell Bank

세포은행의 부분이나 그 세포은행에서 나온 세포배양을 검정하여 세포은행을 평가한다. 이 러한 평가에는 외래오염물질의 부재와 정체확인검사(identity)가 포함된다. 외래오염물질검 사는 bacteria, 곰팡이, mycoplasma와 virus검사가 포함된다. 외래오염virus검사는 세포주의 계대배양내력에 기초하여 일반적인 in vivo 검사, 세포배양접종검사 그리고 다른 이에 동등 한 검사가 포함된다. 특정한 환경에서 관련된 검사목록은 5장 정도관리검사에서 서술된다. 이러한 검사는 세포가 retrovirus나 retrovirus 미립자를 생산하는가를 알기 위해서 보통의 환경에서 수행되어야 한다.

철저한 MCB 정체확인검사는 한번정도 행해져야 하며, 세포의 중요한 성질과 생산과정동안 이러한 성질이 안정하게 유지되는 가를 밝히는데 필요한 모든 검사를 포함해야 한다. 이런 성상화는 다음과 같은 사항을 포함한다.

a. 광학 및 전자현미경으로 측정된 형태
b. 기원된 종 (사람이면 성별)
c. 분열하는 비율
d. 세포가 원하는 목적에 사용될 수 있다는 증거. 만약 세포가 재조합유전자에서 나온 단백질을 생산하는 발현체계를 포함된다면, 발현체제의 복제수와 물리적 상태를 나 타내고 발현체계에 의해 생산되는 단백질의 질과 양을 나타내는 자료
e. 생산하는 데 사용된 세포배양의 일반적인 정체확인을 위해 수행된 주요한 검사를 수행하여야 한다.
f. 세포은행이 원하는 성상을 가진 세포로 구성되어 있다는 것을 증명하는 데 필요한 다른 검사

2. Manufacturer's Working Cell Bank

MCB에서 유래된 MWCB는 배양배지로부터의 오염원에 대한 점검만이 필요하다. 멸균성, mycoplasma, 일반적인 in vivo, in vitro virus 검사가 권유된다.

생산자가 혈청이 포함된 배지에서 무혈청배지로 세포를 옮길 때, 무혈청배지에서 자라는 세 포는 다시 클론화되어 무혈청배지에서 가장 잘 성장하는 새로운 MCB와 MWCB가 만들어 져야 한다.

IV. 생산배양과 생산물검사

생산에 사용된 세포의 정도관리는 생산물 정도관리의 중요한 부분이다. 여기서 서술되는 분 야는 세포배양 배지, 세포배양관리, 특정검사등을 포함한다.

A. 세포배양배지

세포배양배지의 구성과 공급원에 대해 정확히 기록되어야 한다. 유전자치료제제 생산자가 특허된 배지나 배지보충물을 사용하는 경우에는, 배지나 배지보충물의 제작자가 나중에 필 요할 경우 자료를 공급해야 한다.

만약 동물혈청이나 부가물이 세포배양배지에 첨가되면, Bovine Spongiform Encephalopathy 를 유발하는 물질과 같은 외래오염원이 존재하지 않는 것을 증명해야 한다. 이러한 부가물 의 정체, 공급원과 외래오염원의 검사자료를 가지고 있어야 한다. 생산자는 공급자에 의해 제공되는 품질확인증에 기초하여 원료품 인정여부를 결정한다.

동물혈청이 인체에서 알레르기 반응을 나타낼지 모르기 때문에, 생산세포배양에 필요하는 혈청의 농도를 최대한 줄여야 한다. 최종생산물에서의 혈청이나 부가물의 잔류량이 결정되 어야 하며, 1 ppm을 넘지 않아야 할 것이다.

만약 돼지trypsin을 세포계대에 사용한다면, 돼지 parvovirus같은 외래오염물질을 검사하여 야 한다. 유전자치료제제 생산자는 소나 양으로부터 유래된 물질의 공급원에 대한 정보를 가지고 있어야 한다 (부록 1참조)

Penicillin이나 다른 beta lactam 항생제는 생산세포배양에 존재해서는 안된다. 다른 항생제 나 유도물질은 최소 농도로 존재할 수 있다. 그러나 생산물에는 어떠한 항생제나 유도물질 이 존재하지 말아야 한다.

B. 세포배양의 관리

생산물의 성상화와 외래오염물질검사는 유전자치료제제 정도관리의 일부이다. 유전자치료제 제 정도관리는 생산세포배양검사와 공정을 거친 세포배양과 거치지 아니한 세포배양용액의 검사를 포함한다.

세포의 정도관리는 사용된 증식체계의 특성에 따라 달라진다. 세포는 단층배양, 부유배양, 또는 bioreactor에서 증식되며, 단기간, 장기간 또는 무한정 보존될 것이다. 단기간 배양의 경우, 생산물이 세포배양액의 단일수확이나 여러 수확으로부터 얻어진다. 어떤 경우에는 정 도관리검사는 bulk lot으로 채워지기 전에 각각의 수확물에서 행해질 필요가 있다.

만약 생산물이 감염 virus라면, 일반적인 외래virus검사에 사용되는 세포배양에서 한번 또는 그 이상 번식될 것이다. 유전자치료의 벡터로 사용되는 복제되지 않는 virus의 경우, 외래물 질의 존재여부는 보통세포배양에서 측정한다. 이런 경우 생산에 필요한 세포가 포함되는 일 정부분은 대조군으로 보존되어야 한다. 접종되지 않은 대조군 세포배양과 배양액은 외래오 염물질검사를 받아야 한다. (이것은 virus가 중성화되고 민감한 세포배양으로 접종되는 방법 인 생산물정체검사와 혼동되어서는 안 된다)

장기간 배양이 사용되면, 여러 수확은 일정 간격으로 bulk lot에 모아진다. 이런 경우 정도 관리검사는 각각의 bulk lot에서 행해져야 하며, 만약 가능하다면 특정 bulk에 채워진 생산 수확으로부터 분리된 세포에서도 행해질 수 있다. 정도관리검사를 위한 세포는 검사가 최대 한 민감하게 관리되어야 한다. 장기간배양을 종결하는 기준이 만들어져 시행되어야 한다.

Bacteria와 곰팡이의 멸균도검사는 일반적으로 공정을 거치지 않은 bulk lot, 최종 bulk lot, 최종 생산물에서 수행된다. 공정을 거치지 않은 bulk는 생산을 위해 균질한 혼합물을 유일 한 생산물 lot으로 만들어지는 세포배양액을 모아둔 수확물이다. 만약 외래오염물질검사는 초기의 부분과정에서 더욱 민감하지 않는다면, 분리, 정제와 다른 과정으로 좀더 진행되기 전에 이루어져야 한다는 것이 중요하다 (과정을 거치지 않은 bulk는 검사세포배양에서 독성 이 있으나 분리된 bulk는 그렇지 않다). 최종 bulk생산물은 excipient와 섞이고 용기에 채워 지도록 준비된 균질화된 부유액에 농축되고 정제된 생산물이다. 멸균이 필요한 최종 bulk생 산물은 멸균검사를 포함하여 lot 유출검사를 받아야 한다. 또한 최종 생산물은 멸균과 내독 소검사를 받아야 한다.

일반적인 mycoplasma 검사와 in vitro, in vivo 외래 바이러스검사는 생산세포와 공정을 거 치지 않은 bulk 부유액을 사용하여 모든 lot에서 이루어져야 한다. 세포의 정체확인을 위해 서 생산세포에서 lot to lot검사가 행해져야 한다.

이밖에 모든 lot에서 수행되어져야 하는 다른 검사는 모든 생산물에 필요한 검사 (즉 일반 적인 안전성검사)나 특정생산물의 정도를 반영하는 특수한 검사이다. 이 문서에서는 세포주 에서 생산된 생산물에 특이적으로 관련된 검사들에 한해서 서술된다. 생산자는 lot 유출방법 을 만들어 생산물정도의 모든 중요한 면을 보증할 책임이 있다.

V. 정도관리검사

A. Bacteria와 곰팡이 검사
B. Mycoplasma 검사

배양되는 mycoplasma뿐 아니라 배양되지 않는 mycoplasma의 검사가 수행되어야 한다. 곤 충세포주로부터 만들어진 유전자치료제제에 mycoplasma와 spiroplasma가 오염되었는가 검 사하여야 된다. 이 규칙의 부록 2에 mycoplasma를 검사할 수 있는 최신 방법이 서술되었 다.

C. Virus 검사

1. 외래virus 일반검사

세포배양에서는 생산기간 마지막에 viral cytopathic effects와 hemadsorbing virus를 측정해 야 한다. 만약 여러 차례 다른 시간대에 수확되었다면, 각각의 군집이 수집된 시간에 배양을 검사하여야 한다.  공정을 거치지 않은 bulk 군집이 각각 생산될 때, 배양세포, 알(egg)과 생쥐에 그 pool의 일 부분을 다음과 같이 직접 접종하여야 한다.

a. 최소 3가지 다른 단층세포배양에 접종하여야 한다.

(1) 생산에 사용된 세포와 같은 종과 조직의 단층배양
(2) 인간 2배체세포의 단층배양
(3) 원숭이 신장세포의 단층배양

가능한 적게 검사할 샘플을 희석하며, 적어도 2주동안 세포배양을 관찰하여야 한다. 만약 생산세포배양이 인간 cytomegalovirus의 성장을 촉진시키는 것으로 알려진다면, 인간 2배체세포배양을 최소한 4주동안 관찰하여야 한다. 관찰기간 마지막에 혈구흡착 을 검사해야 한다.

b. 동물에서 검사샘플의 부유액이나 용해액의 virus검사를 하여야 한다. 생쥐 (이미 성장했거나 젖먹이 생쥐)와 알(태아가 형성된 암탉의)에서의 검사가 적당하다. 어떤 경우에는 guinea pig, 토끼 또는 원숭이에서의 검사도 가능하다.

2. 외래바이러스 선택검사

생쥐, 쥐, hamster의 항체생산검사 (MAP, RAP, HAP)에 의해 설치류세포주 virus를 검사할 수 있다. Lymphocytic choriomeningitis virus (LCM)는 challenge for non-lethal strain과 같은 in vivo 검사에 의해 검출된다. 인간세포주에서는 Epstein-Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV), hepatitis B and C (HBV, HCV) 같은 인간virus는 적절한 in vitro 기술을 사용하여 검사할 수 있다. 조직공급원과 세포주가 유래된 환자의 병력을 고려 하여 검사되는 virus를 선택할 수 있다.

세포주의 세포형과 공급원따라 다른 세포배양을 사용하여 세포은행을 성상화할 수 있다. 특수한 경우 papilloma virus, adenovirus, herpes virus같은 transforming virus 검사도 제시되고 있다.

3. Retrovirus 검사

검사 sample에서 다음과 같은 방법을 사용하여 retrovirus를 검사해야 한다.

a. Transmission Electron Micros (TEM)

b. 부유액으로부터 최고속원심분리(1시간, 125,000g, 4℃)에 의해 얻어진 pellet에 마그네슘과 망간을 부가 하여 reverse trasncriptase (RT) 분석

c. 감염 분석

생쥐 retrovirus 경우, Mus dunni세포와 같은 민감한 세포주와 검정하는 세포주를 동시배양 하여 낮은 농도의 오염물을 증폭시킬 수 있다. 전자의 세포주는 Molony murine leukemia viruses (MuLVs)를 제외한 모든 MuLVs에 의해 감염될 수 있다. Molony MuLV는 세포주 SC-1를 감염시킨다. 동시배양하여 얻은 부유액을 Mus dunni세포에 첨가하여 MuLV를 검 사한다.

환경에 따라 다양한 다른 검색법도 유용할 수 있다. HY95같은 단일클론항체를 사용한 viable cell immunofluorescence assay (IFA)에 의하여 ecotropic, xenotropic, mink cell focus forming and amphotropic virus를 감염된 Mus dunni세포에서 검출할 수 있다. Amphotropic virus는 PG4 세포를 이용한 feline S+L- 검색법에 의해, xenotropic virus는 mink S+L- 검색법에 의해, ecotropic virus는 D56 세포를 사용한 mouse S+L- 검색법에 의 해 검출될 수 있다.

생쥐외의 retrovirus의 경우, 검사세포주는 인간과 영장류로부터 유래한 virus가 포함된 다양 한 retrovirus가 자랄 수 있는 능력으로 선택되어진다.


탐침혼성화(probe hybridization), PCR 증폭, virus특이단일클론항체 검출방법을 수행함으로 서 특유한 오염원이 존재하는지 더 자세히 알 수 있을 것이다.

D. 종양 형성 검사

설치류에서 유래한 세포주에서는 종양형성를 일반적으로 검사할 필요가 없다. 그러나 인간 외피세포와 생바이러스백신 생산에 사용된 모든 세포주는 검사되어야 한다. 게다가 특별한 경우, 체세포나 유전자치료에 사용된 세포에서는 종양형성검사가 요구된다.

In vivo 검사에 적합한 체계는 다음과 같다.

1. 누드 생쥐(Nu/Nu)
2. Antithymocyte serum (ATS)이나 globulin (ATG)에 의해 면역억제된 갖 태어난 hamster, 생쥐나 쥐
3. 건강한 생쥐로부터 골수가 이식된 흉선이 절제되고 방사선이 조사된 생쥐

모든 경우에 접종물은 0.2 ml 무혈청배지에 부유된 107개의 대조군세포나 검사세포로서 피 부하주사나 근육주사로 투여한다. 최종 생산단계나 그이상의 검사세포와 대조군 종양세포가 적어도 10마리의 동물에 접종되어야 한다. 대조군 종양세포가 주사된 10마리중 9마리에서 종양이 점진적으로 자라는 것을 관측하여야 한다. Antithymocyte로 처리된 갖 태어난 동물 의 경우, KB, HT-1080, FL과 같은 대조군세포로 주사할 때에 전이가 확실해야 한다.

갖 태어난 hamster, 생쥐나 쥐를 사용한 검사체계에서는 태어난 날, 2, 7, 14일에 강력한 0.1ml ATS나 ATG을 피부하주사나 근육주사하여야 한다. 강력한 ATS나 ATG는 동물의 면역체계를 억제하므로 동물이 태어난 날에 종양세포를 접종하였을 때 점진적으로 종양이 형성되고 전이가 일어난다.

모든 검사에서 주사한 부위에 결절이 형성되는지를 일정한 간격으로 관측하고 촉진해야 한 다. 형성되는 결절은 이차원적으로 측정되어 기록하여야 한다. 관찰기간동안 결절이 퇴화되 기 시작하는 동물은 바로 죽이고 조직학적 검사를 한다. 계속적으로 결절이 자라는 동물의 경우 1-2주동안 관찰한다. 결절형성이 없는 동물중에서 반은 3주동안 관찰하고, 나머지 반 은 12주동안 관찰한 뒤 죽이고 조직학적 검사를 한다. 각각의 동물에서 부검을 해야하고 접 종부위와 다른 기관 즉, 림프절, 폐, 뇌, 이자, 신장, 간 같은 부위에서의 종양형성을 조사해 야 한다. 모든 종양과 비슷한 부위와 접종부위를 조직학적으로 조사하여야 한다. 게다가 어 떤 세포는 국소적 종양형성증거없이 전이를 형성하기 때문에 모든 림프절과 폐를 조직학적 으로 검사하여야 한다.

In vivo검사 뿐 아니라, 여러 in vitro검사는 세포주의 성상화에 필요하다. Soft agarose에서 의 colony forming assay와 기관배양에서의 성장은 누드마우스에서의 종양형성보다 좀 더 민감한 분석이라고 알려져 있다. 이러한 in vitro검사는 특히 낮은 계대배양에서는 종양형성 을 하지 않는 세포주에 적합하다. 이러한 검사법은 세포주가 계대하는 동안의 안정성과 비 정상적인 성상이 진전되는 가를 증명할 수 있는 빠르고 값싼 실험방법이다. 이러한 검사법 이 적어도 동물실험만큼 민감하다고 인정되면, 어떤 경우에서는 동물실험을 대신할 수 있을 것이다.

VI. 바이러스제거의 확인

유전자치료제제의 생산에 세포주를 사용하기 위해서는 외래virus오염이 없다는 것을 확인해 야 한다. 세포주가 virus-like paticle와 감염성 virus를 생산하는 지 정도관리할 필요가 있 다. 특히 생산자는 생산