바이오인

출처 : 생물학연구정보센터(BRIC)

CRISPR를 기반으로 한 진핵생물 유전자 교정 기술

정 희 진
DFCI, Harvard Medical School

<요약문>

CRISPR-Cas9 RNA-guided DNA endonuclease는 살아있는 세포 내의 유전자 편집을 시작으로 하여 생명과학의 진보에 공헌하고 있다. 본고에서는 CRISPR 기술을 통한 포유동물의 유전자 편집과 그 다양한 응용을 요약한다. 일반성, DNA 특이성, 생산물 선택성, CRISPR 기술 확장에 관련한 최근의 진보에 대해 설명하고, 이들의 기초연구, 바이오테크놀로지, 치료과학에의 기여에 대해 강조한다.

Key Words: CRISPR, 유전자 편집, 염기 편집, 에피지놈 편집

본 자료는 CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell, 168 (1-2), pp. 20-36.의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

[목 차]
1. 서론

2. 새로운 천연 CRISPR 효소
2.1 Cas9 타겟 범위의 확대
2.2 CRISPR을 바탕으로 한 편집제의 DNA 특이성 개선
2.3 유전체(genome) 편집제의 생산물 선택성 향상

3. 에피지놈 편집(epigenome editing)

4. 유전체(genome) 편집제 및 에피지놈(epigenome) 편집제의 전달

5. CRISPR을 바탕으로 한 유전자 편집의 응용
5.1 사람 초대 세포(human primary cell)에서 유전체(genome) 편집
5.2 CRISPR를 바탕으로 한 사람 유전병 동물모델의 치료
5.3 High-throughput 유전적 screens
5.4 유전자 드라이브

6. 결론

1. 서론
DNA 배열에 원하는 변이를 도입하는 유전자 편집은 의생명과학에 혁명을 초래하였고, 유전질환을 가진 환자에 혁신적 치료법을 제공하는 가능성을 갖고 있다. 궁극적인 유전자 편집기술은 높은 효율과 특이성을 갖으며 원하지 않는 부산물을 수반하지 않도록 원하는 유전자를 편집하는 것이라 할 수 있다. 유전자의 발현을 교정하는 기능 또는 바이러스 감염을 방어하는 기능을 달성하기 위하여 유전자교정단백질이 자연발생적으로 진화한 것을 생각하면, 이러한 이상적인 agent가 자연계에 존재하는 가능성은 낮다. 따라서 연구자들은 특히 사람의 질병에 관련한 동물 모델 및 진핵세포의 유전자 편집의 범위 및 유효성을 높이는 새로운 기술을 개발하는 필요성을 인식하고 있다. 이 목표를 향한 최근의 노력은 비교적 단기간에 현저한 진보를 나타내고 있다.

초기의 유전자 편집은, 내재성 세포의 상동재조합 복구 경로(homologous recombination re-pair pathway)가 살아있는 세포의 일부 유전자를 외래 도너 DNA 배열로 바꾸는 것이 가능하다는 발견에 의해서 가능해졌다. 이 전략을 유전자 편집에 사용하기 위해서는 외래 DNA 배열이 표적 지놈 DNA 부위와 상동성을 갖지 않으면 안된다. 도너 DNA를 형질전환 후, 원하는 유전자 배열에 도입하는 것은 세포의 타입 및 상태에 의존하여 103~109개의 세포 중에 한 개의 비율로 매우 비효율적으로 자연발생한다. 자연적 상동재조합이라 불리는 이 기술은, 마우스 ES 세포에서 사용되어 원하는 유전자를 갖는 마우스의 제작에 응용되고 있다.

자연적 상동재조합을 이용한 편집은, 편집효율이 낮을 뿐만 아니라 외래 DNA 배열이 원하는 배열이 아닌 다른 곳에 무작위로 도입되어 원하지 않는 유전자편집이 유도되는 경우가 있다. 이 한계를 극복하는 방법으로, 효모와 포유류 세포에 길이가 긴 DNA 배열을 인식하여 절단하는 endonuclease를 이용하여 유전자 배열에 이중가닥 절단(double-stranded break, DSB)를 도입하는 방법이 개발되었다. 이 “homology-directed repair” (HDR) 전략은, 타겟 배열에 특이적인 유전자 편집의 효율을 랜덤 도입보다 수백, 수천 배 증가시켰다.

이러한 혁신에도 불구하고, 지놈 편집에는 아직까지 두 가지의 개선이 필요한 점이 있다. 첫 번째로, 비상동말단결합(non-homologous end joining, NHEJ)이 DSB 부위에서 HDR보다도 높은 비율로 발생하여, 표적 배열에 있어서 유전자의 도입과 결손(insertions and deletions, indels)을 초래한다. NHEJ 매개 유전자편집은 유전자 파괴에 유용할 수는 있어도, 정확한 유전자편집을 원할 경우 indels은 원하지 않는 부산물이다. 두 번째로, 기존의 메가뉴클라아제가 원하는 유전자배열을 절단하는 확률은 매우 적기 때문에, 메가뉴클레아제가 인식하는 부위를 유전자배열에 도입하거나 표적배열을 특이적으로 절단하기 위해 메가뉴클레아제를 개량해야 한다. 첫 번째 문제점을 극복하기 위해 최근 여러 연구가 행해지고 있으며 이에 대해서는 본고의 후반부에서 설명하겠다. 두 번째 문제점에 대처하기 위해, 연구자들은 FokI에서 유래하는 비특이적 DNA절단 도메인과 융합된 천연에 존재하는 DNA 결합 도메인을 바탕으로 개량된 뉴클레아제인 ZFNs (zinc-finger nucleases) 및 TALENs (tranion-activator-like effector nucleases)에 초점을 두었다.

대부분의 DNA 결합 단백질과는 달리 zinc-finger 및 TALE의 아미노산배열은 임의의 표적 DNA 배열에 결합하도록 설계하는 것이 가능하기 때문에 ZFNs 및 TALENs은 꽤 높은 특이성을 갖고 타겟 유전자 배열을 절단 가능하다. 하지만 ZFNs의 광범위한 단백질-DNA 접촉 때문에 ZFNs을 설계하는 것이 간단하지 않으며, TALEN 유전자의 경우 자연계에 고빈도로 반복이 되기 때문에 TALEN 유전자를 클로닝하기가 쉽지 않다. 또한 새로운 유전자 배열을 타겟으로 할 때마다 새로운 ZFN 또는 TALEN 단백질을 설계한 후 유전자를 합성하고 발현 및 검증을 해야 하는 필요가 있었다.

RNA 유도 DNA endonuclease로 CRISPR-Cas9가 나타남으로써 상기한 유전자 편집에 있어서의 장벽(각 표적 부위마다 새로운 뉴클레아제를 설계하고 구축해야 함)이 획기적으로 줄어들었다. CRISPR-Cas9 시스템의 특징은 Cas endonuclease 단백질이 “가이드 RNA” 분자와 복합체를 형성하고, 가이드 RNA:genomic DNA 염기쌍 형성 규칙을 따라 타겟 DNA 배열에 위치한다. 타겟 DNA 배열은 가이드 RNA와 상보적이어야 하며, Cas 단백질이 인지하는 PAM (Pro-tospacer-adjacent motif) 배열을 포함해야 한다. 이 새로운 기술은, PAM 배열을 포함해야 한다는 점에서 유전자 편집이 가능한 배열에 약간의 제한을 두고 있지만, ZFNs 및 TALENs에 관여하는 복잡한 단백질의 설계 및 엔지니어링 작업을 타겟 부위에 부합하는 gRNA을 설계하는 것만으로 매우 간단히 대체할 수 있다.

CRISPR-Cas9 메커니즘의 해명과 그것의 진핵생물 유전자 편집에의 응용은 생명과학에 있어서 막대한 영향을 미치고 있다. 새로운 DNA 염기를 유전자 편집의 대상으로 하기 쉽기 때문에, 새로운 유전자 기능을 신속히 발견하고, 세포 및 동물의 새로운 모델을 개발하며, 치료법에의 응용을 향하여 진보하는 것이 가능하게 되었다. 본고에서는 포유류 유전자의 교정 및 기초과학, 바이오테크놀로지, 의학분야에 CRISPR-Cas9을 응용하는 최근의 기술을 요약하겠다.

...................(계속)

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