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[KSMCB 2020년 6월호]

CRISPR-Cas: 유전자 편집 및 유전자치료를 넘어

김택훈(한국과학기술원 화학키노믹스연구센터)

CRISPR-Cas를 이용한 유전자 편집 기술은 유전자치료 분야에서 혁명적 변화를 일으키고 있다. 지금 이 글을 읽고있을 정도로 생명과학에 관심이 있다면 CRISPR-Cas를 이용한 유전자 편집 기술에 대해 충분히 잘 알고 있을 것이라 생각한다 (따로 소개가 필요하다면 2017년 12월 특별기고 "CRISPR-Cas 시스템 연구의 최신 동향: 유전체, 후성유전체 및 RNA 편집"을 참고하길 바란다.)

필자는 CRISPR-Cas를 이용한 신약 타겟 발굴 연구를 주로 하고있는데, 연구에 대해 이야기하다 보면, 많은 이들이 유전자치료 관련 일을 하고있는 것으로 생각하곤 한다. 하지만 CRISPR-Cas는 단순한 유전자 편집 및 치료를 넘어 여러 분야에 응용되고 있다. 이 글에서는 CRISPR-Cas를 이용한 다양한 분야의 응용 현황을 간단히 소개하고자 한다.

CRISPR-Cas를 이용한 세포 내에 사건 및 데이터 기록 생성
생명과학 연구에서 단백질, mRNA, DNA등 무엇을 분석하든지, 우리는 분석하는 그 시점의 것만을 분석할 수 있다. 실시간 생명현상 분석 기법이 많이 개발되어 있지만, 세포를 파괴하지 않는 이미징 기법이 주되며, 이러한 기법이 알려줄 수 있는 정보는 대개 한정적이다. 이런 한계를 극복하기 위해 연구자들은 CRISPR-Cas를 이용해 세포가 특정 사건에 노출되었을 때 세포의 DNA에 유전 가능한 변이를 유도함으로서 DNA 염기서열 변이의 형태로 세포가 스스로 과거 사건을 "기억"할 수 있는 방법들을 고안해냈다[1].

Self targeting/homing guide RNA (gRNA)를 이용한 lineage tracing
CRISPR-Cas를 이용해 lineage tracing을 하는 기법들이 여럿 개발되었다. lineage tracing이란 발생학 및 암생물학에서 자주 쓰이는 기법으로 다세포생물/조직에서 각 세포의 족보를 그리는 기법이다. 예쁜꼬마선충의 959개의 각 체세포의 족보를 그려낸 것이 대표적인 예이다[2]. CRISPR-Cas를 이용한 lineage tracing 기법들은 공통적으로 세포가 Cas9으로 특정한 지놈 DNA에 indel 돌연변이를 여러 번 지속적으로 일으키도록 유도한다. Indel 돌연변이에 의한 염기서열 변이는 무작위적이므로, 같은 gRNA로 유전자 편집이 되어도 염기서열 수준의 변이 결과는 서로 다르다. 서로 염기서열 수준에서 indel 돌연변이의 결과가 다른 것은 세포마다 서로 다른 “바코드”가 새겨진 것으로 생각할 수 있다. 차세대염기서열 (Next Generation Sequencing, NGS) 분석 혹은 FISH를 이용해 이 바코드를 추적하면 각 세포가 어느 세포의 분열에 의해 만들어진 것인지 족보를 만들어낼 수 있다. 한 gRNA로도 여러 번의 indel 돌연변이를 유도하기 위해 gRNA가 편집할 수 있는 타겟 DNA 서열 여러 개를 세포의 지놈에 편입시키는 방법을 쓰기도 하지만[3-5], 개인적으로 특히 창의적이라 생각하는 self-targeting/homing gRNA를 소개하고자 한다[6, 7].

Cas9이 gRNA에 상보적인 염기서열을 가진 DNA를 자른다는 것은 모두 알고있다. 그렇다면 gRNA가 발현되는 DNA 위치는 gRNA와 완벽히 상보적인 염기서열을 가지고있는데 왜 잘리지 않을까? SpCas9은 gRNA가 인지하는 서열 의 3’-옆에 NGG PAM이 있어야만 DNA 절단이 가능한데, gRNA를 발현하는 DNA는 spacer 서열의 3’- 옆이 gRNA의 constant repeat sequence인 –GTT로 시작이 되어 PAM이 없기 때문에 절단이 불가능하다. 그런데 gRNA의 repeat sequence는 일부 염기서열의 변이를 일으켜도 Cas9과 결합 및 DNA 절단 유도가 가능한 것으로 알려져 있다. 그렇다면 gRNA의 repeat sequence를 –GGG로 시작하게 만들어 PAM이 구비되게 하면 어떨까? 연구 결과 repeat sequence가 –GGG로 시작하는 gRNA도 Cas9과 결합하고 DNA 절단에 관여하는데 문제가 없어서 스스로 자신이 발현된 DNA 위치를 절단함이 밝혀졌다. 이 경우 gRNA의 염기서열이 바뀌지만 계속 발현은 되므로 바뀌게 된 DNA 서열에 맞는 gRNA가 결국 발현되어 다시 절단이 가능하다. 결국 PAM 자체가 indel 돌연변이에 의해 없어지지 않는 한 gRNA가 스스로 발현된 DNA 위치에 계속 indel 돌연변이를 유도할 수 있다. 이렇게 설계된 self-targeting/homing gRNA는 하나의 gRNA로도 이전보다 훨씬 많은 종류의 돌연변이를 양성할 수 있고, 이를 통해 새끼 생쥐의 발생 과정의 모든 세포의 lineage tracing을 해내었다[8].

현재 CRISPR-Cas를 이용한 lineage tracing 기법은 조직을 파괴하여 지놈 DNA 추출이 필요하기 때문에 여러 기술의 발전[4]에도 lineage tracing 된 세포들의 종류 (identity)만을 알 수 있을 뿐 위치를 알 수는 없다. 발생학의 입장에선 향후 in situ 수준에서의 CRISPR-Cas를 이용한 lineage tracing 기법의 개발을 기대한다.

세포 안에 디지털 데이터 저장
DNA는 생물의 기원에서부터 쓰여온 가장 오래된 데이터 저장매체이다. DNA는 화학적으로 안정하며 세포의 지놈에 넣어주면 영구 보존되며 복사도 해주고 안의 내용을 구현 (유전자 발현) 해주기도 한다. 하나 단점이 있다면 세포 안의 DNA에 다른 DNA를 추가하거나 기존 DNA의 서열을 바꾸는 것이 쉽지 않다는 것이다.

그런 점에서 CRISPR-Cas는 DNA 데이터 편집을 가능케 해줄 수 있다. CRISPR을 통해 박테리아가 박테리오파지(파지)에 적응면역을 가지게 하는 과정을 살펴보자. Cas1-Cas2가 세포에 침입한 파지 지놈의 일부를 박테리아 지놈의 CRISPR array에 편입시켜 박테리아가 침입한 파지를 '기억'하고, 이것을 gRNA로 발현시킴으로서 해당 DNA 서열을 가진 파지에 대한 면역을 가진다. 연구자들은 박테리아가 Cas1-Cas2를 이용하여 임의의 염기서열의 파지 지놈을 "기억"하는 것에 주목하여, Cas1-Cas2를 이용하여 박테리아에 디지털 데이터를 작성 및 저장하는 데에 성공하였다[9, 10]. 연구자들은 0과 1로 나타내는 임의의 디지털 데이터를 DNA 염기서열로 변환하고, 이것을 Cas1-Cas2를 발현하는 박테리아에 전기천공법으로 전달했다. Cas1-Cas2에 의해 박테리아의 CRISPR array에 저장된 데이터는 NGS를 이용해 불러오기가 가능하며, 이것을 다시 컴퓨터 데이터로 변환을 하면, 디지털 이미지나 동영상을 다시 구현할 수 있음을 보였다.

DNA에 데이터를 저장한다니 허무맹랑하게 느껴질 수도 있다. 하지만 우리는 현재 매일 250만 테라바이트의 새로운 데이터가 생기는 데이터의 홍수 속에 살고 있고, 언젠가 기존 저장매체만으로는 데이터 저장의 한계가 올 수 있다. 물론 위 연구에서 저장한 디지털 데이터는 2.6킬로바이트, 5프레임의 작은 흑백 동영상일 뿐이며 아직 많은 발전이 필요하다. 향후 DNA에 기반한 데이터 저장의 발전과 미래를 기대해 본다.

신약 타겟 발굴

CRISPR-Cas를 이용한 기능유전체학 연구 및 신약 타겟 발굴 연구도 현재 활발히 진행중이다. 특정 표현형을 유도하는 새로운 유전자를 찾는 스크리닝은 이번 세기 초에만 해도 거대한 장비가 필요한 비싸고 어려운 연구였지만, NGS와 함께 가능해진 Pooled 스크리닝 기법을 통해 개별 실험실에서도 가능해졌다. Pooled 스크리닝 기법은 후보유전자들을 결손시킬 수 있는 gRNA를 발현시키는 lentivirus가 모두 섞여있는 상태로 세포에 처리한다. 이 결과로 각 세포들은 서로 다른 유전자가 각각 결손된 채로 서로 섞여서 배양된다. 마치 야생의 적자생존 법칙처럼 세포들이 어떤 유전자가 결손되었나에 따라 생존 및 증식 속도가 다르므로 시간이 지나면서 특정 유전자가 결손된 세포들의 빈도가 변화한다. NGS 분석을 통해 어떤 gRNA가 발현되는 세포들이 생존 혹은 사멸되었는지 각각의 빈도 변화를 확인함으로서 세포 생존 및 증식에 관여된 유전자를 찾을 수 있다. 단순히 세포 생존 및 증식에 관여된 유전자 발굴하는 것뿐만 아니라 항암제를 처리해서 항암제 내성을 없앨 수 있는 유전자를 찾는다거나, 특정 유전자의 발현을 형광으로 볼 수 있는 표지단백질을 이용해 특정 유전자의 발현을 유도하는 유전자를 찾은 스크리닝도 가능하다.

CRISPR-Cas9을 이용한 knockout 스크리닝은 short hairpin (shRNA)를 이용한 knockdown 스크리닝에 비해 몇가지 장점을 가지고 있다. CRISPR 스크리닝은 유전자가 완전 결손되는 만큼 shRNA 스크리닝에 비해 형질의 변화가 훨씬 극적이고 일관성이 높아서 더 많은 유효유전자 (hits)를 찾아낼 수 있다[11]. 또한 shRNA를 이용한 스크리닝은 knockdown 스크리닝 만이 가능하나, CRISPR 스크리닝은, wild type Cas9을 이용한 knockout screening 뿐만 아니라, 유전자 가위 효소 능력이 없는 dCas9에 VP64와 같은 전사활성화요소나, KRAB과 같은 전사억제요소를 결합시킨 단백질을 이용하면 각각 gene activation 스크리닝이나 knockdown 스크리닝도 가능해 훨씬 유용성이 크다.

많은 연구자들이 CRISPR 스크리닝을 이용한 기능유전체학 연구를 하고 있으며, MIT/Harvard의 Broad institute (https://depmap.org/portal/) 나 영국의 Sanger institute (https://score.depmap.sanger.ac.uk/,[12])에서는 수백개 세포주에서 지놈 전체의 CRISPR 스크리닝을 수행하였고 그 결과를 공개하였다. Pooled CRISPR 스크리닝도 한계가 있다. 스크리닝 결과를 NGS에 의존하기 때문에, 세포 생존/사멸, 표지유전자 발현 같은 간단한 차이만이 분석 가능하다. 그리고 한 세포당 하나의 유전자만 결손시켜 그 형질을 스크리닝할 수 있다. 이 같은 한계점을 돌파하기 위한 여러 접근이 성과를 내고 있다[13, 14]. 이 결과들을 이용한 더 효과적인 표적치료제의 개발을 기대한다.

바이러스 감염 진단
CRISPR-Cas를 이용해 현재 유행하고 있는 코로나19와 같은 바이러스를 진단할 수 있다. CRISPR-Cas를 이용하면 gRNA 설계로 임의의 서열을 가진 핵산을 절단하는 nuclease를 손쉽게 만들 수 있기 때문에, Cas의 nuclease 활성을 정량화할 수 있는 기법만 개발하면 어떤 바이러스든 손쉽게 검출할 수 있다. CRISPR-Cas를 이용한 핵산 검출법은 크게 Cas9, Cas13 혹은 Cas12를 이용한 것으로 나눌 수 있다. 허용된 지면 상 이 중 Cas13을 이용한 핵산 검출법에 주목해보겠다[15],.

RNA를 절단하는 Cas13은 gRNA에 결합하는 타겟 RNA를 자를 때, 그 RNA 뿐만 아니라 주위에 있는 다른 RNA도 염기서열과 관계 없이 자르는 collateral 활성을 가지고 있다[16]. 이를 활용한 바이러스 진단 키트는 절단되었을 때 형광을 띌 수 있는 probe와 검출하고자 하는 RNA와 결합하는 gRNA, 그리고 Cas13으로 구성되어있다. 분석 시료에 검출하고자 하는 RNA가 있다면 Cas13의 collateral 활성에 의해 probe가 절단되어 형광을 띄게 된다[17-19]. 이를 통해 시료에 검출하고자 하는 바이러스 RNA/DNA의 존재 여부를 현재 PCR을 이용한 핵산 검출의 민감도에 비견될 정도인 atto (10-18)M 수준의 민감도로 검출할 수 있다.

CRISPR-Cas를 이용한 진단은 37도에서 가능해 PCR 기반 진단키트에 비해 진단장비가 열악한 개발도상국 및 최빈국에서도 현장에서 바로, 더 빠른 시간 내에 신뢰성 있는 결과를 낼 수 있는 장점이 있다. 현재 코로나19와 같은 급박한 상황에 Cas13을 이용한 진단키트가 당장 상용화되기는 어려울 것으로 보이나, 최근 Sherlock Biosciences 와 같은 스타트업 회사에서 개발한 CRISPR-Cas를 이용한 코로나19 진단키트가 미국 FDA의 긴급승인을 받는 등 향후 바이러스의 진단키트의 기준이 바뀔 가능성이 있다고 생각한다.

유전자 드라이브를 이용한 생태계 조절

유전자 드라이브란 heterozygous diploid 개체에서 한 쪽의 allele이 다른 쪽의 allele을 자신과 같은 것으로 바꾸게 만드는 유전공학적 장치이다. 예를 들어 유전자 드라이브를 가진 allele를 “D” 정상 allele을 wild type (WT)으로 명명하면, D/WT 개체의 WT allele이 D allele에 의해 편집됨으로서 D/D 유전자형을 가지게 된다. 실험실에서 D allele을 가진 개체를 제작하여 방사하면, 처음 방사한 개체수가 적더라도 기존 야생 개체군과 유전자 드라이브를 가진 개체 사이의 새끼들은 모두 유전자 드라이브를 가지게 되어, 유전자 드라이브가 개체군의 유전자형을 잠식한다. 유전자 드라이브는 1960년대에 제안된 아이디어로[20], 번식력을 떨어뜨리는 유전자형을 유전자 드라이브에 연결하면 개체군의 번식력을 전체적으로 감소시킬 수 있을 것이라 주장되었으나, 이것을 가능케하는 유전공학적 기법이 존재하지 않았다.

이젠 CRISPR-Cas9으로 유전자 드라이브가 쉽게 구현될 수 있다. CRISPR-Cas9을 이용한 유전자 드라이브는 자연의 이기적 유전자(selfish gene)의 일종인 homing endonuclease gene (HEG)을 모사하고 있다[21]. Cas9을 이용한 유전자 드라이브는 내가 타겟하고자 하는 WT allele과 같은 염기서열을 가진 homology arm을 양쪽 끝에 가지고 있고, 그 사이에 WT allele을 절단할 수 있는 gRNA와 Cas9을 발현하는 DNA를 설계한다. 이 유전자 드라이브 allele과 WT allele이 함께 한 개체에 있으면 유전자 드라이브에 있는 Cas9에 의해 WT allele이 절단되게 되고, 이것이 다시 수복 (repair)될 때, 유전자 드라이브가 가지고 있는 homology arm을 이용해 homology directed repair (HDR)을 유도하게 된다. 결국 수복 후에는 WT allele이 유전자 드라이브 allele로 바뀌게 된다. 연구자들은 유전자 드라이브를 homozygous 돌연변이가 일어났을 때 암컷의 불임을 유도하는 유전자에 설계했다[22, 23]. 이 결과, 체세포 상 heterozygous 암컷 모기는 생존은 하지만 생식세포가 유전자 드라이브에 의해 homozygous 돌연변이가 되어 알을 낳을 수 없고, 수컷이 가진 유전자 드라이브는 생식세포가 homozygous 돌연변이인 상태에서 모기 개체군 내에서 계속 퍼져나가기 때문에 전체적으로 모기의 번식력이 크게 감소하게 된다. 이 같은 연구는 실험실의 케이지 안에 격리된 모기 개체군에서 7~11세대 이내에 모기의 번식력이 거의 사라짐이 확인되었다.

유전자 드라이브는 상당히 흥미로운 기술이지만, 생태계를 교란시킬 수 있는 아주 위험한 기술이기도 하다. 최소한의 안전성을 확보하는 장치도 개발되고 있지만[24], 유전자 드라이브는 널리 상용화되기는 어렵다고 전망된다. 하지만 아프리카의 부르키나파소와 같은 말라리에에 의해 매해 수 만명이 죽는 국가에서는 유전자 드라이브를 이용한 모기 퇴치가 실행되고 있다. 어쩌면 인간에게 극적인 해악을 끼치는 종들에 대해서는 유전자 드라이브 기술이 적용될 수도 있지 않을까 조심스레 생각해본다.

맺음말
허용된 지면 상 소개하지 못했지만 CRISPR-Cas에 의해 조절되는 약물전달/전자회로[25] 등 수많은 창의적인 영감들이 현실이 되고있다. CRISPR-Cas는 현재 생물학이 할 수 있는 연구의 저변을 넓혔고, 유전자치료가 아니더라도 많은 응용분야가 있다. Cas 단백질들은 그 유전자 가위의 활성을 이용한 응용도 중요하지만, gRNA에 의해 내가 원하는 임의의 염기서열을 가진 핵산에 Cas 단백질을 위치시킬 수 있다는 것에 매력점이 있다고 생각한다. 짧은 염기서열로도 수천가지 다양성을 확보할 수 있으므로 서로 독립적인 조절을 받는 "부품"을 생명체에 혹은 (진단키트, 생체재료와 같이) 무생물체에 설계할 수 있는 점에 주목한 다양한 응용을 기대한다.

...................(계속)

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