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[BRIC View 동향리포트]

현미경(공초점 현미경, 전자 현미경, 정량위상 현미경)을 활용한 최근 기술 동향

김혜진(Tomocube, Inc.)

요약문

생명 현상의 이해를 위해서는 눈에 보이지 않는 단백질 수준의 규명이 필요하다. 그래서 많은 과학자들은 눈에 보이지 않는 미시의 세계를 관찰하기 위해 현미경 기술을 발달시켜오고 있다. 본 보고서에서는 현재 생명과학 연구 분야에 많이 이용되고 있는 공초점 현미경(Confocal microscope), 투과 전자 현미경(Transmission electron microscope)과 주사 전자 현미경(Scanning electron microscope) 그리고 정량 위상 현미경의 특징과 응용 분야에 대해서 살펴보았다. 공초점 현미경은 형광으로 표지된 시료를 정확한 초점으로 영상화 함으로써 시각적으로 아주 예쁜 이미지를 만들어 낼 수 있다. 하지만, 광원으로 가시광선을 이용하기 때문에 해상도가 120 nm 정도라는 분해능의 한계와 형광으로 표지를 해야 한다는 단점이 있다. 전자 현미경은 1 nm 이하의 분해능을 가져 아주 미세한 구조까지 시각화 할 수 있다는 장점이 있지만, 광원으로 전자빔을 사용하기 때문에 현미경의 내부를 진공으로 유지해야 하고 살아있는 시료를 관찰하는 것은 불가능하다. 최근에 상용화된 정량 위상 현미경은 살아있는 세포를 형광 물질 등의 전처리 없이 있는 그대로 관찰하고 정량화할 수 있다는 장점이 있지만, 시료를 둘러싸고 있는 매질과 시료의 투명성에 의존한다는 한계가 있다. 연구자들은 이런 광학계들의 특징과 장단점을 잘 이용하여 수행하고 있는 연구에 가장 적합한 현미경을 선택하여 실험에 이용해야 한다. 또한, 각 현미경의 단점과 한계를 극복하기 위한 연구들이 많이 진행되고 있으니 멀지 않은 시점에 시료의 한계가 없는 초고분해능 현미경의 개발을 기대해 보아도 좋겠다.

Key Words: Imaging, Microscope, Confocal micros, SEM, TEM, QPI

1. 서론

세포의 영어 명칭인 ‘Cell‘은 1665 년 로버트 훅 (Robert hooke, 1635-1703) 이라는 영국의 과학자가 자신이 개발한 현미경을 통해 코르크의 구조를 관찰하면서 본인의 저서인 '마이크로그라피아(Micrographia)'에서 최초로 사용한 용어이다. 로버트 훅은 이 책에서 바늘의 끝, 비단, 유리, 모래 등과 같은 무생물과 물고기의 비늘, 곤충의 눈과 다리, 날개 등의 동물 그리고 곰팡이와 이끼 등에 이르는 생물을 관찰한 내용을 담았다. 그중 코르크를 현미경으로 관찰하여 본 모습이 벌집과 같은 작은 방이 모여 있는 구조를 가졌다고 하여 "세포(cell)"라는 이름을 붙이게 되었고, 지금까지 생물체의 기본 단위를 부르는 명칭이 되었다.

'세포(cell)'라는 이름의 유래에서도 알 수 있듯이 현미경 기술의 발달은 생물학의 발전에 중요한 역할을 했다. 과학자들은 눈에 보이지 않은 작은 물체와 생명 현상을 보고 싶어 하는 호기심으로 현미경이라는 발명품을 만들어 냈고, 1590년경 네덜란드의 안경 제작사인 자카리아스 얀센(Zacharia Janssen, 1585-1632)은 지금의 현미경 형태의 대물렌즈와 접안렌즈가 결함되어 있는 복합현미경을 만들어 내게 되었다. 과학자들은 렌즈가 가지는 구면수차와 색수차의 한계를 극복하는 방법을 고안해 내며 해상도가 높은 현미경을 개발하게 된다. 하지만, 살아있는 생물체를 관찰할 수 있는 유일한 방법인 광학 현미경에도 어쩔 수 없는 '회절한계'라는 해상도의 한계가 있었다. 1873년 에른스트 아베가 광학현미경의 공간분해능의 한계는 관찰에 사용되는 빛의 절반이라고 정의하였다. 즉, 가시광선을 광원으로 이용하는 광학 현미경의 해상도는 200nm가 한계라고 여겨졌다.

광학 현미경의 해상도의 한계를 극복하기 위해 많은 과학자들이 다양한 시도를 하였는데, 가시광선보다 더 짧은 파장을 가진 파동을 광원으로 이용한 현미경을 만들고자 하였다. 1926년 독일의 한스 브루슈(Hans Brush, 1884-1973)가 전자렌즈(Electromignetic lens)를 개발하면서 전자현미경의 역사가 시작되었다. 1931년, 독일의 에른스트 루스카(Ernst Ruska, 1906-1988)와 막스 놀(Max Knoll, 1897-1969)이 전자를 진공 속에서 가속시킴으로써 가시광선의 파장의 10만 분의 1에 이러는 짧은 파동을 만들 수 있다는 사실을 발견하였고 이러한 전자의 성질을 이용한 전자현미경의 프로토타입을 만들게 되었다. 1931년 최초의 전자 현미경인 투과 전자 현미경(TEM, transmission electron microscope)가 개발되게 되고, 시작 시점의 해상도는 광학현미경에도 못 미치는 수준이었으나 꾸준한 기술 개발로 1939년에는 상용화된 전자 현미경을 제작하게 된다. 투과 전자 현미경은 전자를 가속한 전자빔이 얇게 자른 시료를 통과하면서 형광 스크린에 상을 맺어 보여주는 원리이다. 이 때문에 100nm 수준의 얆은 시료만 관찰한다는 한계가 있었다. 이런 투과 전자 현미경으로 잘 관찰할 수 없는 두꺼운 시료를 관찰하고 싶었던 과학자인 벨기에의 만프레드 본 아덴(Manfred von Ardenne, 1907-1997)은 1937년 주사 전자 현미경(SEM, scanning electron micro-scope)을 개발한다. 주사 전자 현미경은 전자빔으로 시료의 표면을 쏘일 때 시료로부터 튕겨져 나온 전자를 측정하여 스크린에 이미지를 표현하는 방식이다. 이렇게 가시광선 대신 전자빔을 사용하는 전자 현미경의 개발로 원자 수준의 관찰이 가능하게 되었다.

하지만, 전자 현미경은 회절 한계를 극복하기 위해 광원을 전자빔으로 대신하게 되면서 진공상태에서만 시료를 관찰할 수 있다는 단점을 가지게 된다. 생체 분다들은 진공 상태에서 물이 증발하고 구조가 붕괴되기 때문에 이것은 치명적인 한계가 되었고, 살아있는 생명체 그대로를 관찰할 수 있는 해상도의 한계는 여전히 200nm라고 여겨졌다.

과학자들을 살아있는 투명한 시료를 관찰하기 위해 광학계의 개발을 거듭하였고, 세포소기관의 굴절률 차이에 의해 생기는 위상의 차이를 명암으로 나타낸 위상차 현미경(Phase contrast microscope)과 이보다 조금 더 확실한 명암의 차이를 나타내 주는 차등 간섭 현미경(Differential interference contrast microscope, DIC)을 발명하였다. 이러한 광학 현미경의 거듭된 발전에도 위상차로만 세포의 내부 구조를 구별하기에는 어려움이 있었다. 그러던 중 형광 단백질의 발견이 해결책이 되었다.

일본의 과학자 시모무라 오사무(1929-2018)는 해파리의 한 종인 Aequorea Victoria의 형광물질을 연구하던 중 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)을 처음 발견하게 되었다. 그 후 단파장을 쪼이면 녹색 형광을 내는 이 단백질의 DNA 정보가 밝혀진 뒤, 238개의 아미노산으로 이루어진 이 단백질을 유전공학 기법으로 조작하여 많은 생명 현상들을 형광 단백질로 표지하여 관찰하게 된다. 과학자들은 여러 종류의 형광 단백질을 개발하게 되고 이는 형광 현미경을 통해 관찰되어 세포 안에서 일어나는 아주 작은 일들을 여러 색의 형광으로 표시할 수 있게 되었다.

널리 이용되던 형광 현미경(Wide field fluorescence microscope)의 한계를 극복하기 위해 1957년 마빈 민스키(Marvin Lee Minsky, 1927-2016)는 공초점 현미겨(Confocal microscope)을 발명한다 [1]. 현재까지 널리 이용되고 있는 공초점 현미경은 형광 현미경과 원리는 같으나, 시료를 관찰할 때 조사범위가 좁은 레이저 광원을 사용하며 핀홀(pinhole)이 광전 증폭관(photomultiplier tube, PMT) 앞에 있어서 초점이 맞지 않는 곳의 빛을 차단하게 된다. 따라서 초점 거리에 일치하는 영상만 선택적으로 얻어내기 때문에 영상의 해상도가 증가하게 된다. 이를 응용하여 , 초점 거리를 일정하게 변화시킴으로써 3차원 영상을 만들어 내는 기술도 발전하게 되어 생명과학뿐만 아니라재료과학 및 나노과학 분야 에도 사용되고 있다.

형광단백질을 이용한 광학 기술은 점차 발전하여 초고해상도 현미경 (Super resolution microscope) 기술들을 개발하게 된다. 초고해상도 현미경을 이용하면 10nm의 해상도로 생명체를 관찰할 수 있는 시대가 되었다. 하지만 현미경마다 강점이 있다면 분명히 한계점도 존재하고 있다. 물리학자들이 개발한 이 엄청난 발명품들 속에서 우리의 목적에 맞는 현미경을 올바르게 선택하고 가치 있게 이용해야 한다. 본 리포트에서는 공초점 현미경과 전자 현미경이 현재 시점에서 가지는 기술적 위치를 살펴보고 이를 통해 어떤 분야에서 응용되고 있는지 살펴보고자 한다.

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